溶解氧（DO）是好氧培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵參數(shù)，由于其溶解度低，氧氣在某些培養(yǎng)條件下會受到限制。本研究開發(fā)了一種預(yù)測一次性搖瓶中不同培養(yǎng)條件下氧轉(zhuǎn)移速率、氧飽和度和最大細(xì)胞濃度的新方法。因此，確定體積氣液傳質(zhì)系數(shù)（kLa）從灌裝量、容器尺寸和攪拌速度已經(jīng)確定。使用SFR搖瓶讀數(shù)儀進(jìn)行氧氣測量。谷氨酸棒狀桿菌的測試表明，使用這種新方法可以實現(xiàn)可靠的培養(yǎng)條件設(shè)計，并且可以不受限制地預(yù)測最大可能的細(xì)胞濃度。

圖1：本研究使用了帶有集成化學(xué)光學(xué)傳感器（SFS，PreSens）的擋板（左）和非擋板（右）一次性搖瓶。

       搖瓶具有多種優(yōu)點，例如易于操作和高通量，因此廣泛用于研究和工業(yè)。這就是為什么已經(jīng)在幾項研究中研究了搖瓶中的溶解氧濃度和傳質(zhì)。然而，這些信息從未用于實驗設(shè)計中的初步考慮，或好氧培養(yǎng)中DO的預(yù)測，盡管這將具有顯著的優(yōu)勢并防止由于氧氣限制而導(dǎo)致的失敗。在這項研究中，我們開發(fā)了一種可靠預(yù)測有氧生長過程中氧飽和度的方法。隨著帶有集成傳感器的一次性培養(yǎng)容器市場不斷增長，我們的實驗集中在這種類型的塑料搖瓶上。我們對 k 進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查L一個帶和不帶擋板的一次性搖瓶，并使用SFR搖瓶閱讀器實現(xiàn)氧氣監(jiān)測，允許在容器中進(jìn)行在線監(jiān)測。得到的 k 的數(shù)學(xué)相關(guān)性L然后對谷氨酸梭菌的模型培養(yǎng)進(jìn)行計算，并事先確定在沒有氧氣限制的情況下可以獲得的最大細(xì)胞濃度。

圖2：k的相關(guān)性La，30°C下填充體積為10%的擋板搖瓶的燒瓶尺寸和振蕩頻率。

     圖3：以葡萄糖為碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中谷氨酸的生長和耗氧量。在250 mL擋板搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，填充體積為30%（A）和10%填充體積（B），轉(zhuǎn)速為150rpm。該設(shè)置中的非氧限制期（灰色區(qū)域）用于確定比生長速率、μ和比攝氧速率 qO2預(yù)測值（藍(lán)色）和實驗數(shù)據(jù)（黑色）顯示出好的一致性（B）。

材料與方法

      kLa在不同尺寸（125、250、500 mL）的擋板和非擋板搖瓶中定量，并帶有集成的氧氣和pH傳感器（SFS傳感器燒瓶，PreSens）。在100 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，在30和37°C的軌道搖床中進(jìn)行測量，振蕩直徑為50 mm。 使用SFR搖瓶讀數(shù)儀（PreSens）實現(xiàn)溶解氧監(jiān)測。搖瓶用緩沖液和Co（NO）平衡3)2（0.1 毫米）。通過添加 200 gL 獲得缺氧-1那2所以3儲備溶液。工作體積（10 - 40 %最大填充量）和振蕩頻率（50、150、250 rpm）各不相同，所有測量一式三份進(jìn)行。kLa使用Berkley MADONNA（Ver.8.0.1）測定血氧飽和度的20-90%。對于 kL估計值、燒瓶大小、振蕩頻率和 K 之間的經(jīng)驗相關(guān)性La 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)匯編。數(shù)學(xué)擬合要么使用高斯函數(shù)，要么使用拋物線函數(shù)[1]。C. 谷氨酸ATCC 13032用礦物鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)物在250mL擋板搖瓶（SFS，PreSens）中生長，溫度為30°C，150rpm，填充體積為10%或30%。后者用于確定比生長速率和比攝氧速率。這些實驗確定的生長和攝氧值用于預(yù)測谷氨酸梭菌在30 °C，150 rpm下在250 mL搖瓶中以10%填充體積生長期間生物質(zhì)濃度的增加和DO的降低。

kL搖瓶中的定量

      kLa是通過在充滿緩沖液的擋板和非擋板搖瓶中進(jìn)行在線氧氣監(jiān)測來確定的。通過添加Na去除氧氣2所以3到系統(tǒng)。當(dāng)氧化還原反應(yīng)由Co催化2+完成，燒瓶內(nèi)的溶解氧增加，可用于測定KLa 對于給定條件。對于所研究的搖瓶，kL值長達(dá)350小時-1都下定了。對于無擋板搖瓶，kLA 總體較低，最大 KLa 值為 100 小時-1[1]. 搖晃頻率對氧氣轉(zhuǎn)移的影響顯著。容器尺寸對k幾乎沒有任何統(tǒng)計學(xué)相關(guān)影響La的無擋板搖瓶，但對k有一定影響L一個在困惑的燒瓶中。從30°C到37°C的溫升幾乎沒有影響kL一個。然而，對于每個研究的填充體積，在30和37°C下建立了個體相關(guān)性。在圖2中，這是在30°C下以10%填充體積的擋板搖瓶所示的。獲得了k的高斯擬合的優(yōu)參數(shù)估計L擋板燒瓶和 K 拋物線擬合的值La 非擋板燒瓶的值。

谷氨酸的生長和耗氧量

      圖3 A顯示了谷氨酸梭菌培養(yǎng)物在250 mL搖瓶中的生長和耗氧量，填充量為30%，振蕩頻率為150 rpm。可以觀察到，DO下降得非常快，并在4小時后變得受限。測定生長和攝氧量至0.38小時-1和 14.2 毫摩爾克-1h-1分別。這些值用于預(yù)測細(xì)胞生長的時間過程和在另一個迄今為止未經(jīng)測試的條件下培養(yǎng)谷氨酸梭菌的溶解氧。計算在250 mL擋板搖瓶中進(jìn)行實驗設(shè)置，填充率為10%，振蕩頻率為150 rpm。kLa計算至190小時-1接種物濃度為 0.2 g CDW L-1確定細(xì)胞生長的時間過程，如圖3 B（藍(lán)色實線）所示;考慮到所有參數(shù)，計算了DO（藍(lán)色虛線）。在進(jìn)行實驗和監(jiān)測培養(yǎng)性能時，可以驗證氧氣消耗量確實得到了很好的預(yù)測。實驗值和預(yù)測值幾乎相同。限制氧氣供應(yīng)時的預(yù)期細(xì)胞濃度（4.3 g L-1） 也與實驗實現(xiàn)的 4.6 ± 0.3 g L 的細(xì)胞濃度相匹配-1在 20% 的 DO 下。

結(jié)論

      本研究結(jié)果清楚地表明，該方法可用于預(yù)測一次性搖瓶的最佳培養(yǎng)條件和耗氧量。隨著已建立的相關(guān)性 kL計算可以從基于緩沖液的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)搖瓶培養(yǎng)。預(yù)測特定實驗裝置的氧氣可用性的能力可以顯著改善實驗設(shè)計。SFR系統(tǒng)專為一次性搖瓶中的氧氣監(jiān)測而設(shè)計，在這項研究中被證明是一個有價值的工具，為這種新方法的開發(fā)及其后續(xù)驗證提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。